关键词:肾脏;组织;蛋白提取

     

    8.1.1 物品准备:冻存的肾脏组织、RIPA(强)裂解液、cocktail、蛋白磷酸酶抑制剂、眼科镊、精密天平、研钵,碾磨棒、液氮、保温桶、锡纸、1。5ml EP管、移液器、超声破碎仪、台式低温离心机、冰盒

    8.1.2 蛋白裂解液配制:cocktail/蛋白磷酸酶抑制剂:RIPA裂解液=1:100

    8.1.3 肾脏组织裂解步骤

    (1)将装有肾脏组织的冻存管全部放在装有液氮的保温桶里;

    (2)用眼科镊从冻存管中将包裹组织的锡纸夹出。迅速称量肾脏组织的质量;

    (3)快速将肾脏组织用新的锡纸包好并对折两次,放入研钵中;

    (4)向研钵中加入少量液氮(以刚好没过锡纸为宜);

    (5)使用研磨棒垂直捶打组织数次,注意不能旋转研磨锡纸(可重复第4-5步1-2次);

    (6)将研磨成粉末的组织迅速转移至冰上的1.5ml EP管里;

    (7)将配制好的蛋白裂解液按10ml/mg的比例加入EP管中;

    (8)待全部组织按上述步骤完成后,使用超声破碎仪将组织超声1-2次(超3S,停5S,一次共9s);

    (9)冰上静置半小时以充分裂解;

    (10)将上述EP管放入已预冷至4℃的离心机中,12000g离心15min

    (11)分别吸取上清至另一标记好的EP管中。